微生物平板計數法 vs 血球計數板操作避坑

一、兩種方法的本質差異

‌二、平板計數法操作避坑指南‌

‌1. 菌落重疊‌

原因‌：涂布不均勻或稀釋度不足（未達到30-300菌落/平板）。

‌避坑‌：

梯度稀釋至少做5個梯度（如10²~10），選擇2~3個合適稀釋度的平板計數。

涂布時用無菌涂布棒從高濃度向低濃度操作，避免交叉污染。

‌2. 隱形菌落‌

‌現象‌：微小菌落、擴散菌落（如枯草芽孢桿菌）難以肉眼識別。

‌避坑‌：

培養后立即觀察（避免菌落干燥收縮）。

對擴散性菌落使用“分區計數法”，僅計算獨立菌落中心區域。

‌3. 培養基的問題‌

問題‌：凝固不勻或表面冷凝水導致菌落蔓延。

避坑‌：

倒平板前確保培養基冷卻至50℃左右（手握不燙）。

倒置培養平板，避免冷凝水流入。

‌三、血球計數板法操作避坑指南‌

‌1. 細胞分布‌

‌問題‌：細胞聚集在計數室邊緣或同一方格內。

‌避坑‌：

菌液混勻后靜置1分鐘再取樣，減少氣泡干擾。

計數時遵循“計上不計下，計左不計右”原則（避免重復計數）。

‌2. 顯微鏡的“視覺欺騙”‌

現象‌：雜質顆粒、氣泡被誤認為細胞。

‌避坑‌：

用亞甲基藍染色區分死/活酵母（活細胞拒染，死細胞藍色）。

調整顯微鏡光圈和焦距，觀察細胞立體結構（雜質通常扁平）。

‌3. 計算公式的易錯點‌

公式‌：細胞數/mL = 平均每格細胞數 × 稀釋倍數 × 10

易錯點‌：

忽略計數室體積（0.1mm³）與單位換算（1mL=10³mm³）。

未校正稀釋倍數（如原液已稀釋10倍）。

‌四、兩種方法的“致命翻車場景”對照表‌

‌五、實驗結果驗證技巧‌

‌交叉驗證法‌：

用血球計數板初步估算菌液濃度，再選擇合適稀釋度進行平板計數。

質控菌株法‌：

使用已知濃度的標準菌株（如大腸桿菌ATCC 25922）驗證方法準確性。

‌重復實驗法‌：

同一稀釋度至少倒3個平板，或血球計數板重復取樣3次，取平均值。

‌六、避坑口訣‌

‌平板計數‌：

“梯度稀釋要到位，涂布均勻不偷懶；

菌落獨立是關鍵，30-300最保險。”

血球計數‌：

“細胞混勻再上樣，顯微鏡下細端詳；

雜質死菌要分辨，公式換算莫慌張。”

平板計數法流程： 

菌液 → 梯度稀釋 → 涂布平板 → 倒置培養 → 計數 → 計算CFU/mL

血球計數板流程： 

菌液 → 混勻 → 蓋玻片壓緊 → 顯微鏡觀察 → 計數 → 計算細胞數/mL